20. Kalenderwoche
Hin zum reinen Produkt
Da die Aufreinigung von Proteinen in industriellem Maßstab in einem Mehrschritt-Verfahren chromatographisch machbar aber aufwändig ist, sind Erleichterungen etabliert worden, insbesondere die Bildung von Fusionsproteinen. Die cDNA des Zielproteins wird mit der cDNA eines leicht aufzureinigenden Proteins verknüpft (im Verknüpfungsbereich wird eine Sequenz – wie ein Scharnier – eingebaut, die eine Spaltstelle für eine Protease enthält). Ein Beispiel für ein solches Protein ist Glutathionyl S-Transferase (ein Entgiftungsenzym (GST); was ist Glutathion (GSH)? Was bedeutet „SH“?).
Im Arbeitsablauf wird, wie gewohnt, das Fusionsprotein(paar) in Bakterien produziert; der Extrakt dieser Bakterien wird am Säulenmaterial mit immobilisierten Glutathion fraktioniert: GST bindet, alles andere nicht. Nach gründlichem Waschen (Entfernung aller Begleitproteine) wird eluiert (z. B. mit freiem GSH). Diese Fraktion (nach Abtrennung von GSH: wie?) wird mit der Protease gespalten (ein nicht spaltbares Addukt aus Protease und GST ist ideal: warum?) und rechromatographiert. Jetzt werden alle GSTs abgetrennt, im Durchfluß befindet sich Ihr Produkt.
Optimierung des Produktes
Aktivität und Stabilität von Proteinen werden in der Evolution durch Mutationen erhöht. Dieser Prozeß wird im Labor durch zielgerichtete Mutagene nachvollzogen, z. B. im M13 Bakteriophagensystem (s. z. B. Stryer).
Dieser Phage enthält ringförmige einzelsträngige DNA (ss = single stranded). In der Wirtszelle wird aus ssDNA doppelsträngige DNA, aus der dann ssDNA zur Verpackung in das Kapsid (reifer Phage) entsteht. Wirtszellen werden nicht lysiert.
Im „gaped duplex“ Verfahren (mit M13) wird das Zielgen in dsDNA des M13 Phagen (mit einer amber Mutation in einem für die Replikation wichtigen Gen; was ist eine amber Mutation? Begriff „suppressor tRNA“) eingebaut und ssDNA (am/Zielgen) gewonnen. Die Wirtsbakterien müssen also „amber“ ausgleichen (supprimieren) (spezieller Suppressorstamm). Linearisierte Wild-Typ (WT) DNA (keine aber Mutation) wird nach „Aufschmelzen“ zusammen mit dieser ssDNA zur Bildung von neuen (hybriden) ds (am/WT) DNA genutzt (jetzt entsteht ein „gapped duplex“). Ein Oligonukleotid (mit gewünschter Mutation) wird jetzt (wie bei PCR) als Primer zur ds Bildung in der Lücke eingesetzt, und mit DNA Polymerase/DNA Ligase wird die Lücke geschlossen. Diese dsDNA besteht somit aus ssDNA Paar mit am/keine Mutation & WT/Zeilmutation Strängen.
Vorsicht: an der Mutationsstelle besteht ein Defekt, der normalerweise repariert würde: also muß die Transfektion zur DNA Vervielfältigung in einen reparaturdefizienten Stamm erfolgen.
Die Selektion der Produkte erfolgt dann in einem Bakterienstamm, der „amber“ nicht supprimiert. Es entsteht somit ausschließlich WT/Zielmutation DNA zur genetischen Neukombination und rekombinanten Expression (bitte eine Zeichnung zum beschriebenen Verlauf anfertigen).
Beispiele zur Wahl der Mutation
- ein fertiges Protein entsteht (wie Insulin) durch Bildung von Disulfidbrücken aus Peptiden, enthält jedoch zusätzlich Cysteine (also kann ein Gemisch entstehen: wovon?). Warum wollen Sie Cysteine entfernen? Welche Aminosäuren wählen Sie? Ist Glu günstig?
- die Oxidation von Met zum Sulfoxid mindert die Proteinaktivität: was tun Sie?
- wie erhöhen Sie die Thermostabilität (z. B. von Enzymen zur Verwendung in Waschmitteln bei 60° C)?
- Sie kennen mindestens eine natürliche nachträgliche Umdeutung des genetischen Codes, die – im Effekt vergleichbar – eine neue Aminosäure einbaut, die 21. Aminosäure. Wie läuft dieses „recoding“ ab und warum?
- In der Natur findet man in Proteinen eng verwandter Spezies sog. synonyme Mutationen: was bedeutet dieser Begriff (auch chemisch betrachtet)? Welche Aminosäuren erfüllen dieses Kriterium in den Fällen von Arg, Asp, Phe und Val?
Haben Sie Fragen?
Wenn ja, gehen Sie hierfür auf die sli.do Internetseite: https://app.sli.do/event/u8b3pzuq
Der Code für Biochemie Fragen im SS 2021 lautet: # 955466