19. Kalenderwoche

Von Vektoren zum Produkt

Sie haben jetzt Ihren Expessionsvektor konzipiert und (gedanklich) hergestellt.

• Wie erfolgt die Einschleusung des fremden genetischen Materials in Ihr Expressionssystem (z. B. Bakterien), Transfektion genannt?

Gängige Methoden sind Lipofektion (Einschluß in Liposomen oder ionische Bindung an kationische Lipidstoffe (welches natürliche Glycerophosphatid ist positiv geladen?), Elektroporation und Mikroinjektion (in eukaryontischen Zellen auch Viren).

Nach der Aufnahme der fremden DNA steuert der Promoter die Initiation der Transkription.

• Was ist transiente, was stabile Expression?
• Warum sollte man keine Gene sondern cDNA (also mRNA als Matrize) für die Transfektion zum Zwecke der Proteinproduktion in Bakterien verwenden?
• Warum enthalten Promotoren TATA-reiche Sequenzbereiche?
• Was wird passieren, wenn Vektoren über keinen eigenen „ori“ („origin of replication“) verfügen?
• Wie weisen Sie nach, ob das gewünschte Prokukt in Zellen hergestellt wird (z. B. mit Blotting, aber nicht Southern oder Northern)?

Sie stellen (bestürzt) fest, daß trotz Transkription (und wieder wird dieser Nachweis mit einem Blottingverfahren geführt: welches? Ginge auch „PCR“?). Kein Produkt oder nur wenig entsteht. Warum nicht, und was tun Sie?

Ein häufig auftretendes Problem besteht in unterschiedlichen „codon (triplett) usage“ zwischen eubakteriellen und eukaryontischen Zellen.

• Was bedeutet dies? 
• Warum bezeichnet man den genetischen code als degeneriert? 
• Warum ist dies so (4 Basen können 64 Tripletts generieren ....)? 
• Was tun Sie, um die Bakterienzelle zur Proteinproduktion zu „überreden“?).

Aber dies ist nicht das einzige Problem: sie haben ein Produkt, aber es ist nicht löslich (in ‚“inclusion bodies“) oder es ist nicht aktiv.

Im Falle von Einschlußkörpern versuchen Sie die Produktion zu drosseln (wie?), um Aggregatbildung zu reduzieren. Protein aus dieser Fraktion läßt sich auch löslich machen (wie? Was ist ein chaotropes Reagenz?). Denaturiertes Protein läßt sich (in gewissem Umfang) in die native Konformation falten (welche Sekundarstrukturelemente kennen Sie?).

Auch lösliches Protein kann nach bakterieller Produktion inaktiv sein: hier spielt das Fehlen einer bestimmten Form der ko- und posttranslationalen Modifikation von Proteinen eine Rolle: welche?

• Warum hilft hier Expression in eukaryontischen Expressionssystemen? 
• Welche Rolle spielt das sog. Signalpeptid? 

Dieser Typ von Modifizierung wird auch genutzt, um Dopingsünder zu überführen (z. B. im Falle von Erythropoietin).

• Warum ist die rekombinante Gewinnung von Proteinen mit Quartärstruktur ggf. sehr schwierig? 
• Warum hat die Insulinproduktion ein zusätzliches Problem bereitet (was ist das bioaktive Produkt?)? 
• Welche fundamentale Bedeutung spielen Cysteine in diesem Zusammenhang? 
• Spielen Signalpeptid und proteolytische Prozessierung eine Rolle?

Und nun zur Aufreinigung des Produktes aus Extrakten:

Die Säulenchromatographie spielt hier eine entscheidende Rolle.

• Welche Verfahren dieser Art kennen Sie? 
• Welches Verfahren liefert den höchsten Reinigungsfaktor? 
• Welche Verfahren benutzen sie zur Reinheitskontrolle des Produktes (Nachweis von Verunreinigungen, von Modifikationen und von Bildung der natürlichen Struktur (Bestandteile wie im Fall des Insulins, Quartärstruktur)?

Haben Sie Fragen?

Wenn ja, gehen Sie hierfür auf die sli.do Internetseite: https://app.sli.do/event/u8b3pzuq

Der Code für Biochemie Fragen im SS 2021 lautet: # 955466